實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團(tuán)，在整個(gè)PCR過程中通過收集熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每一個(gè)循環(huán)中擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法。

①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會(huì)在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。因此，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號(hào)就會(huì)與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強(qiáng)度也會(huì)隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對(duì)較低；使用方便；對(duì)DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測(cè)靈敏度高。

缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴(kuò)增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)。

②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是早用于定量的方法，也是臨床檢測(cè)中zui常用的檢測(cè)方法。PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對(duì)引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸，5'端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter, R），3'端標(biāo)記一個(gè)淬滅基團(tuán)（Quencher, Q）。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，以至于無法檢測(cè)到熒光信號(hào)；而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)（在延伸階段），探針會(huì)被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射底的熒光不會(huì)再被吸收，從而可以在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成wan全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號(hào)累積的越多，熒光強(qiáng)度越大。

優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測(cè)；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時(shí)間和原料成本。

缺點(diǎn)：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以完，本底較高；檢測(cè)結(jié)果很難判斷實(shí)際的擴(kuò)增特性。                        

注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)。