測序時引物為什么有時有突變？

測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法徹底解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學反應，合成效率*高也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不徹底造成的，Caping反應主要是封閉極少數(shù)5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產(chǎn)品被亞克隆轉化到大腸桿菌中，可能被xi菌中修復系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉化為烯醇異構體 （脫嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA復制和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫嘌呤現(xiàn)象在富含嘌呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫嘌呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規(guī)模化**中。