PCR反應(yīng)依然存在各種各樣的問題

（1）不出現(xiàn)擴增條帶：PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括模版 DNA 特性、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量及其活性、PCR 反應(yīng)條件等，應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行原因分析。首先，模版質(zhì)和量的不同引起的反應(yīng)效果可能也不盡相同，模版的來源不同，則在反應(yīng)中得到用量不同，擴增效

率也會不同。如真核基因組 DNA 作為模版時，其使用量應(yīng)比原核多，當(dāng)然模版的純度也有一定影響，如其中含有雜蛋白質(zhì)或 Taq 酶抑制劑時，會影響反應(yīng)效率。其次，由于 Taq 酶容

易失活或污染，會影響反應(yīng)效果。第三，引物質(zhì)量、濃度、兩條引物的濃度是否一致是影響PCR 反應(yīng)的常見原因。第四，PCR 產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h 以內(nèi)，*好于當(dāng)日電泳檢測，超過 48h 后帶型不規(guī)則，甚至消失。

（2）假陽性：指陰性樣品出現(xiàn)目的 DNA 擴增條帶的現(xiàn)象，其原因是存在模版或擴增產(chǎn)物的交叉污染。這種污染有兩種可能：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。

這種假陽性的解決方法：

①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將目的 DNA 吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。

②所有能高壓的試劑或器材均應(yīng)高壓消 du,所用離心管及進樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。

 ③必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補后,可擴增出PCR 產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式 PCR 方法來減輕或消除

（3）非特異性擴增帶：PCR 擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或同時出現(xiàn)多個條帶,包括特異性擴增帶和非特異性條帶。究其原應(yīng),首先是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。其次是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,或與 PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。再次是酶不合格或酶量過多。其對策包括重新設(shè)計引物,減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)，適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)等。

（4）出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR 擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶,原因可能是模板降解,酶的用量過多或酶的質(zhì)量差,也有可能是 dNTP 濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多等引起的。解決方法包括更換模板,減少酶用量,適當(dāng)降低 dNTP 的濃度和 Mg2+濃度,增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。