抗體特異性的選擇考慮因素
抗體的特異性是指與相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識別能力??贵w的特異性高,它的識別能力就強。
特異性的選擇主要需要考慮因素:蛋白特異性、種屬特異性、實驗方法特異性、標(biāo)記物的特異性。
1、蛋白特異性
針對需要檢測的蛋白查找抗體,幾個細節(jié)要區(qū)分:
a. 重組蛋白如果不是全長表達,則需要注意抗體的免yi 原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi)。
b. 內(nèi)源性蛋白zui 好能清楚其剪切與修飾的方式,特殊表型的蛋白需要進行序列比對,并結(jié)合抗體免yi 原序列,查看交叉反應(yīng)的情況。
c. 磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點,不同位點的磷酸化意味著可能有不同的機制存在,不宜一概而論。
2、種屬特異性
同種蛋白不同物種,有著或大或小的差異。
a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計多肽抗原的,根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng)。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息。
b.一些稀有種屬很難找到抗體,可以通過蛋白的序列比對,選擇同源序列免yi 的抗體,不過一般這種情況商不會受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴,如果可以申請到免費的抗體樣品,則利于抗體選擇。
3、實驗方法特異性
目前使用抗體的實驗方法有很多,不同的使用方法過程中,因為對蛋白樣品的處理方式不一樣,蛋白的含量有差異,對抗體的識別表位和效價要求都是不一樣的。
4、標(biāo)記物的特異性
一般基于實驗操作的實驗方法不會使用帶有標(biāo)記的一抗,比如 WB、IHC 等,都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達到結(jié)果呈現(xiàn)的目的。但是基于儀器分析的一些實驗,可能就會使用到直接標(biāo)記的一抗,比如流式實驗。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免yi熒光雙標(biāo)實驗中,需要選配不同的熒光標(biāo)記物。